Tabla 1. Características de los SNP estudiados.

Tabla 2. Secuencias de reconocimiento de las enzimas de restricción NsiI, HhaI y longitud de los f...

Tabla 3. Frecuencia de los diferentes genotipos correspondientes a los sitios polimórficos HhaI y ...

Figura 1. Producto de amplificación de ADN para rs7216389. a. Marcador de PM. b. Ampliconpara rs72...

Figura 2. Producto de digestión con HhaI de ADN para rs7216389 para 4 muestras controles (N) y 3 pr...

Introducción

El asma es una enfermedad inflamatoria crónica de las vías aéreas inferiores caracterizada por una obstrucción variable del flujo de aire, con síntomas que incluyen episodios recurrentes de obstrucción bronquial que revierten espontáneamente o por acción de la medicación1. Estudios genéticos relacionados con el asma revelan que se trata de una enfermedad compleja y heterogénea con un claro componente hereditario, aunque no se adapta a un patrón clásico de herencia mendeliana, sino que es el resultado de la interacción de múltiples regiones genéticas entre sí y con factores ambientales2.

Los polimorfismos pueden ser responsables de cambios en la expresión de los genes (aumento, disminución o ningún efecto). Ciertas variaciones genéticas en la expresión de algunos genes podrían tener un efecto sobre el asma y explicar, en parte, algunas características específicas y la predisposición individual a desarrollar esta enfermedad3. Recientemente se ha realizado un amplio estudio del genoma, mediante el análisis de múltiples marcadores de polimorfismos de nucleótidos únicos (SNP) en poblaciones europeas4, detectándose SNP en el cromosoma 17q21 fuertemente asociados con asma en la infancia y además fuertemente asociados con los niveles de transcriptos del gen ORMDL3 5. Entre esos polimorfismos se destaca por su alto grado de asociación con la enfermedad el SNP rs7216389 detectado en el gen GSDML y que es adyacente a ORMDL3. Posteriormente otros autores intentaron confirmar estas asociaciones entre las variantes genéticas y asma y apoyaron la relación entre el marcador rs7216389 y asma en la infancia, en muestras poblacionales de Japón, Escocia, China y México6-10.

Por otra parte, se realizó un estudio en dos grupos de niños norteamericanos con asma, uno con ancestros de origen europeo y otro africano, en el que analizaron por primera vez polimorfismos correspondientes al cromosoma 1q3111. De estos polimorfismos, el SNP rs2786098 detectado en el gen CRB1 fue el más fuertemente asociado con asma en los individuos con ancestros europeos y también significativamente asociado con asma en los niños con ancestros de origen africano.

En contraste con los estudios genéticos llevados a cabo en relación al asma, las investigaciones sobre sus causas ambientales son mucho más escasas. La influencia del medioambiente en el desarrollo de asma debe ser tenida en cuenta, considerando el rápido incremento de la prevalencia de esta enfermedad y otros desórdenes respiratorios en niños durante las últimas décadas12. Al respecto, estudios epidemiológicos sugieren que la exposición crónica a contaminantes relacionados con el tráfico automotor, plantas petroquímicas, partículas procedentes de la industria, etc., tienen efectos adversos sobre el desarrollo y función pulmonar e incrementan la mortalidad y/o morbilidad respiratoria en niños13-18, especialmente en ciudades altamente contaminadas de países en desarrollo19. Además, el estudio de poblaciones del mismo origen étnico pero que divergen en la exposición a ciertos medioambientes, como por ejemplo entre poblaciones rurales y urbanas son argumentos convincentes20 y han generado un marcado interés por establecer la influencia que tendría la exposición a contaminantes del aire. Determinados factores medioambientales juegan un rol considerable. Entre estos factores ambientales se ha identificado por ejemplo que la exposición al humo del tabaco a una edad temprana constituye un riesgo de desarrollar asma e interactúa con la susceptibilidad genética de desarrollar la enfermedad21,22. Particularmente, Bouzigon et al.23 concluyeron que el incremento en el riesgo de padecer asma conferido por variantes genéticas del cromosoma 17q21 parece estar restringido a un comienzo de la enfermedad en una edad temprana (cuatro años o menos) y que el riesgo es aún más incrementado por la exposición a humo de tabaco del medioambiente a una edad temprana. En este sentido, se ha sugerido que este hallazgo que relaciona la edad y el rol de la exposición temprana al humo de tabaco requiere confirmación por nuevos estudios24.

En base a los antecedentes expuestos se pretende analizar la contribución al riesgo de padecer asma, en niños de una provincia argentina, a los polimorfismos en los cromosomas 17q21 (SNP rs7216389) y 1q31 (SNP rs2786098) y su asociación a la susceptibilidad genética en el desarrollo del asma.

Materiales y métodos

Tipo de estudio

Investigación de tipo observacional – transversal de casos y controles sobre parámetros genéticos en un grupo de niños con asma y un grupo control.

Comité de Ética y consentimiento

informado

Este estudio de investigación fue aprobado por el Comité de Ética del Polo Sanitario del Niño y del Adulto (CIEIS) y registrado en el Registro Provincial de Investigación en Salud (RePIS) con el Nº 012. El estudio se realizó de acuerdo con los principios de la Declaración de Helsinki. A todos los pacientes se les informó en qué consiste el trabajo de investigación y se les solicitó la firma del consentimiento informado a los padres y de asentimiento a los niños mayores de 7 años para participar en el estudio.

Población de estudio

Niños de ambos sexos, menores de 18 años que concurrieron al Servicio de Alergia de un Hospital de niños de Córdoba y con diagnóstico clínico de asma según lo establecido por GINA, The Global Initiative for Asthma25,26. Todos fueron evaluados clínicamente (examen físico y anamnesis) para descartar otras patologías, se les realizó tests cutáneos mediante la técnica de prick test y espirometría en aquellos pacientes que pudieron colaborar con la técnica. Este grupo de pacientes con asma fue considerado la población problema. El grupo de niños menores de 18 años que requerían estudios prequirúrgicos de rutina por cirugías menores no urgentes, previamente sanos y con examen físico normal al momento del estudio fue considerado como la población control.

Recolección de muestras

Se tomaron muestras de sangre por punción venosa y con anticoagulante a todos los pacientes de la población problema y la población control. Todos los niños de la población problema fueron evaluados confeccionando una Historia Clínica diseñada para tal fin para descartar otras patologías.

Extracción de ADN

Se realizó la extracción de ADN a partir de núcleos celulares de los glóbulos blancos de sangre periférica anticoagulada mediante el procedimiento CTAB modificado27. En este procedimiento la sangre total se homogeniza con Tris-HCl 10 mM pH 7,5 y EDTA 10 mM pH 8 y se centrifuga descartando el sobrenadante y recuperando el pellet, resuspendiéndolo en solución CTAB 2%. El pellet resuspendido se incuba 1 hora a 60ºC. Al cabo de dicho tiempo se agrega cloroformo-alcohol isoamílico 24/1 v/v y se centrifuga a máxima velocidad recuperando la fase superior para precipitar el ADN extraído con isopropanol y posteriormente lavarlo con etanol 70%. Con el propósito de constatar la extracción de ADN, los extractos fueron visualizados en geles de agarosa al 1% teñidos con bromuro de etidio. En el gel se sembró 10 μL del ADN genómico extraído para cada muestra con 1,5 μL de buffer de corrida.

Detección de polimorfismos

de nucleótido único (SNP)

Para detectar ambos SNP se realizaron las siguientes técnicas de biología molecular:

A. Diseño de primers específicos: se diseñaron oligonucleótidos complementarios con cada una de las hebras de ADN en los extremos del segmento de interés (primers), para la amplificación de cada región de ADN donde se encontrarían los polimorfismos, a partir de secuencias de esas regiones en humanos existentes en el Banco de Genes. A través de la página web www.idtdna.com/ANALYZER/Applications/OligoAnalyzer, se verificó que los primers diseñados no formaran dímeros ni horquillas y se determinó la temperatura de melting óptima para cada uno de ellos (Tabla 1).

B. Amplificación de ADN: los fragmentos de ADN se amplificaron mediante el método de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Las reacciones de amplificación se llevaron a cabo mediante un Ciclador Térmico Professional Basic (Biometra). Las amplificaciones para la detección del rs7216389 fueron en 25 µl de una solución que contenía: Tris-HCl (10 mM, pH=8,3), KCl (50 mM), MgCl2 (1,5 mM), los cebadores de cada reacción (10 µM), dNTPs (200 µM de cada uno), ADN extraído y 1 U de ADN polimerasa Go. Las condiciones de ciclado fueron una primera etapa a 94ºC durante 5 min de desnaturalización inicial, seguido de 35 ciclos de 35 s a 94ºC, 60 s a 60,6ºC y 60 s a 72ºC, con un etapa de extensión final a 72ºC por 5 min. Las amplificaciones para la detección del rs 2786098 fueron en 25 µl de una solución que contenía: Tris-HCl (10 mM, pH=8,3), KCl (50 mM), MgCl2 (3 mM), los cebadores de cada reacción (10 µM), dNTPs (200 µM de cada uno), ADN extraído y 1 U de ADN polimerasa Go. Las condiciones de ciclado fueron una primera etapa a 94ºC durante 5 min de desnaturalización inicial, seguido de 35 ciclos de 35 s a 94ºC, 60 s a 61,8ºC y 60 s a 72ºC, con un etapa de extensión final a 72ºC por 5 min. Con el propósito de constatar la correcta amplificación de los segmentos de ADN, los productos de PCR fueron visualizados en geles de agarosa al 1% teñidos con bromuro de etidio. En el gel se sembró 10 μl del ADN genómico extraído para cada muestra con 1,5 μl de buffer de corrida. También se sembró el marcador de tamaño molecular 1 Kb DNA ladder (Invitrogen lifetechnologies) a fin de estimar la concentración de ADN genómico total obtenido en la extracción. Todas las extracciones se conservaron en buffer TE a –20ºC. Los productos de PCR se purificaron mediante un kit de purificación de PCR (QIAquick, QIAGEN) para verificar la amplificación de la región correcta y confirmar la presencia de los polimorfismos descriptos en humanos mediante secuenciamiento directo.

C. Secuenciamiento de ADN: las reacciones de secuenciamiento se llevaron a cabo mediante el método de terminación de síntesis de cadena con didesoxinucleótidos (Sanger et al., 1977), utilizando un secuenciador automático (ABI Prism 377, Applied Biosystems). Los primers utilizados para las reacciones de PCR fueron también empleados para el secuenciamiento de sus productos. Se determinaron las secuencias en ambas hebras de los fragmentos de ADN a analizar.

D. Detección de los SNP: para detectar los SNP propuestos en un gran número de muestras, se utilizó el análisis de restricción para la digestión de los fragmentos de ADN amplificados por PCR. Las enzimas de restricción se analizaron mediante el programa NEB Cutter 2.0. A partir de los patrones electroforéticos obtenidos se determinaron los distintos genotipos. Por convención se designaron con minúscula aquellos alelos que presentaron sitio de corte para la enzima correspondiente (n y h para NsiI y HhaI, respectivamente) y con mayúscula aquellos alelos que no presentaron sitio de corte (N y H para NsiI y HhaI respectivamente). En la Tabla 2 se detallan los sitios de reconocimiento de cada enzima y las longitudes de los fragmentos correspondientes a los distintos alelos, tras la digestión con las enzimas de restricción.

La digestión para el SNP 17q21 fue realizada con 10 U/ml de la enzima NsiI y para el SNP 7q31 fue realizada con 10 U/ml de la enzima HhaI (Thermoscientific, Promega) resuspendidas en buffer constituido por tris-acetato 33 mM pH=7,9, acetato de magnesio 10 mM, acetato de potasio 66 mM y 0,1 mg/ml de albúmina de suero bovino, a 37ºC durante 12 horas.

La determinación de los polimorfismos se realizó luego de la digestión de los productos de PCR mediante su separación en geles de agarosa al 1% teñidos con bromuro de etidio (RFLP-PCR). En el gel se sembró 10 μl del producto de digestión de cada muestra con 1,5 μl de buffer de corrida. También se sembró el marcador de tamaño molecular 1Kb DNA ladder (Invitrogen life technologies).

Análisis estadísticos

Los datos se analizarán por medio de un software SPSS para Windows XP versión 17 (SPSS, Inc, Chicago, IL, USA). Se utilizó el test de Chi cuadrado para comparar las frecuencias genotípicas observadas con aquellas esperadas en caso de cumplirse el equilibrio de Hardy Weinberg. La asociación de los genotipos correspondientes a los diferentes sitios polimórficos con los factores medioambientales se analizaron mediante el test de ANOVA. Las diferencias se consideraron estadísticamente significativas cuando p< 0,05.

Resultados

Amplificación de los fragmentos de ADN

Se extrajo ADN de 28 muestras pertenecientes a la población control y 23 a la población problema para el SNP 17q21 y de 26 muestras pertenecientes a la población control y 32 a la población problema para el SNP 1q31. Para los SNP estudiados se diseñaron los primers específicos que lograron amplificar un solo fragmento de ADN para cada uno. En la Figura 1 se puede observar el fragmento amplificado para SNP 17q21 y para el 1q31. Los fragmentos amplificados por PCR se secuenciaron y esto permitió confirmar que se trataba de las secuencias deseadas para cada SNP.

Análisis de restricción

Los fragmentos amplificados para los dos SNP estudiados se sometieron a digestión con sus respectivas enzimas de restricción según Tabla 2 y se obtuvieron patrones de corte según la presencia de uno y otro alelo en la muestra analizada. En la Figura 2 se observan como ejemplo, los resultados obtenidos para el análisis de restricción para el SNP 1q31 con la enzima HhaI.

Frecuencias alélicas en el grupo

control y en los pacientes con asma:

Los fragmentos amplificados para ambos SNP se sometieron a digestión con las enzimas de restricción según Tabla 2 y se obtuvieron los fragmentos correspondientes a los alelos H y h o N y n, según la presencia del polimorfismo.

En la Tabla 3 se muestra la frecuencia de los diferentes genotipos encontrados en pacientes con asma y en grupo control.

Las frecuencias alélicas fueron similares en ambos grupos estudiados (Tabla 3). No se encontró diferencias entre las frecuencias genotípicas observadas y las esperadas. Estos resultados indicarían que las proporciones entre los diferentes genotipos estuvieron de acuerdo con el equilibrio de Hardy Weinberg, tanto en el grupo control como en el grupo de pacientes con asma.

En la Tabla 3 se puede observar que en el sitio polimórfico HhaI, los grupos mostraron una distribución genotípica diferente: el genotipo HH o Hh fue más abundante en control respecto a pacientes con asma (71,53 vs. 21,87%). Por el contrario, el genotipo hh fue más abundante en el grupo de pacientes con asma respecto al grupo control (78,12 vs. 28,57%, respectivamente).

En relación al genotipo hh, se observó mayor frecuencia entre pacientes con asma con respecto al genotipo HH o Hh OR=8,93 (IC95%: 2,76-28,84) de manera significativa (p< 1e-4). Por otro lado, en el sitio polimórfico NsiI los grupos mostraron una distribución genotípica semejante, es decir que no hubo asociación significativa de este SNP en los grupos estudiados.

Discusión

El asma es una de las enfermedades respiratorias más comunes en niños preescolares, es una causa importante de morbilidad e implica costos elevados para su manejo y tratamiento. Al ser el asma una enfermedad de herencia multifactorial, la identificación de polimorfismos en genes relacionados con el desarrollo de la fisiopatología es muy importante ya que permite identificar a los individuos con genotipos de susceptibilidad, con lo que se logra establecer pronósticos de correlación genotipo-fenotipo y escoger terapéuticas individualizadas que favorezcan a los pacientes25,26,29.

Los resultados de este trabajo muestran que entre las frecuencias alélicas estudiadas no se encontró diferencias entre lo observado y lo esperado, es decir que las proporciones entre los diferentes genotipos estuvieron de acuerdo con el equilibrio de Hardy Weinberg, tanto en el grupo control como en el grupo de pacientes con asma.

El análisis de la distribución de los genotipos en el sitio polimórfico HhaI del SNP rs2786098 muestra mayor prevalencia del genotipo HH o Hh en las pacientes con asma que en el grupo control. La distribución genotípica del sitios polimórfico NsiI es similar entre las pacientes y controles. Esto puede deberse al tamaño muestral, pues en este sitio polimórfico el grupo de pacientes con el genotipo NN era de dos.

Lo más relevante de este estudio es confirmar la asociación del genotipo hh con asma en la población de niños estudiada. Si bien sería necesario un gran número de casos para confirmar esta asociación del SNP rs2786098 en los pacientes con asma, es de destacar que una situación similar se detectó en el trabajo de Sleiman et al.11 en niños con ancestros africanos y europeos. Este hallazgo permitiría proponer este polimorfismo como un indicador de riesgo de padecer asma en la infancia.

La posibilidad de predecir oportunamente el riesgo de padecer asma en niños y poder tomar las medidas preventivas y terapéuticas más adecuadas, en base a determinantes genéticos tales como los polimorfismos estudiados, favorecería una práctica médica más individualizada que contribuiría a mejorar la calidad de vida de las pacientes pediátricos con asma.

Estudios de asociación de otros genes candidatos con riesgo de padecer asma en niños con otros parámetros del medioambiente serían de gran importancia, ya que permitirían la identificación de marcadores genéticos de riesgo.

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Polimorfismos genéticos asociados con riesgo de tener asma en la infancia en una provincia de Argentina

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