Introducción

 

El Trypanosoma cruzi, agente etiológico de la enfermedad de Chagas, afecta a aproximadamente 2.500.000 de personas en nuestro país y 18 millones en América latina.1, 2 Este protozoario presenta en el hospedador una forma intracelular, amastigote, que se replica activamente y una forma extracelular infectante, el tripomastigote. Esto motiva que para controlar la infección se requiera una potente respuesta inmune celular y humoral.3,4 En el hombre la enfermedad presenta períodos clínicos e inmunológicos diferentes: el agudo caracterizado por la presencia de tripomastigotes en sangre, asociado a fenómenos de inmunosupresión,5,6 que transcurre asintomática en el 95% de los casos7 y remite espontáneamente, para entrar en una segunda fase indeterminada, al cabo de 3 o 4 meses, pudiendo cursar toda la vida sin manifestaciones clínicas. La misma se caracteriza por bajas parasitemias y serología positiva y, en años posteriores, aproximadamente el 30% de los individuos infectados pasan al período crónico, con distinto grado de sintomatología ya sean cardiopatías o patologías digestivas.7-9

La respuesta inmune contra el T. cruzi involucra muchos componentes, tanto efectores como reguladores. La inmunosupresión inespecífica que ocurre en la fase aguda de la infección y la capacidad que tiene el T. cruzi para adaptarse y evadir esta respuesta le permiten invadir las células y diseminarse, por lo cual la permanencia del parásito puede prolongarse en los tejidos del hospedador debido a que su eliminación no es completa.6,10,11

A los fines de conocer aspectos de la fisiopatogenia de la infección por T. cruzi, se han desarrollado modelos experimentales murinos, que permiten avanzar en el conocimiento de algunos mecanismos que intervienen en la patogenia empleando un número definido de parásitos infectantes y fijando el momento de inicio de la infección. De esta forma se ha demostrado que el período agudo experimental induce una respuesta con diferentes patrones en los distintos compartimentos del sistema inmune, esplenomegalia y expansión del tejido linfoide subcutáneo, activación policlonal persistente de linfocitos T y B, y paralelamente atrofia en timo y ganglios mesentéricos.12

Un evento crítico en etapas tempranas de la infección es el resultado de la interacción célula–parásito, en la cual el macrófago tiene un rol esencial. Así, al fagocitar al parásito, permite que éste se desarrolle intracelularmente; sin embargo, en períodos posteriores estas mismas células, mediante metabolitos tóxicos, inducen su eliminación. Por lo tanto, la evolución de la infección dependerá de un delicado balance entre las estrategias de evasión del parásito y los mecanismos microbicidas del macrófago,13, 14 entre ellos la producción de NO y la liberación de citocinas proinflamatorias

La infección por T. cruzi activa asimismo la síntesis de IL-12, IFN-γ y TNF-α que estimulan a su vez a los macrófagos para la inducción de NOSi, responsable de la producción de NO, con potentes efectos oxidantes y citotóxicos.14

A su vez, la concentración de NO puede inducir inmunosupresión en el hospedador, lo cual facilita la instalación y diseminación del parásito en diferentes linajes celulares.15 Por lo tanto, la repuesta inmune frente a la infección por T. cruzi es muy compleja, y el amplio espectro de mecanismos que limitan la parasitemia también podría intervenir en la fisiopatogenia de la enfermedad.

El objetivo del presente trabajo fue estudiar en un modelo experimental murino, en peritoneo (sitio de inoculación), algunos mediadores de respuesta innata en las primeras horas de infección con T. cruzi y la respuesta adaptativa al final de la fase aguda, a los fines de analizar su posible relación con la fisiopatogenia de la enfermedad experimental.

 

Materiales y métodos

 

Parásitos

Trypanosoma cruzi: las formas tripomastigotes de la cepa Tulahuén se mantuvieron mediante repiques semanales en ratones BALB/c. Se obtuvo sangre de dichos animales, por punción cardíaca, previa anestesia con éter, durante el pico de parasitemia.

Animales

Los estudios se realizaron empleando lotes de 6 ratones cepa Balb/c, de 3-4 semanas de edad, de ambos sexos, mantenidos según condiciones estándares en el bioterio de la División de Parasitología del Laboratorio de Control Nacional de Vectores:

a. Los ratones controles (C) recibieron PBS por vía intraperitoneal

b. Los animales infectados (I) fueron inoculados por vía intraperitoneal con 1.500 tripomastigotes de T. cruzi. Las parasitemias fueron evaluadas por el método de Pizzi,16 los días 10, 15 y 20 posinfección.

 

Obtención de líquido peritoneal

Las células peritoneales de ambos grupos de animales se obtuvieron por lavado del peritoneo con 2,5 ml de medio RPMI suplementado con 10% de suero fetal bovino en diferentes momentos: previo a la infección, durante las primeras horas y 15 y 20 días posinfección.

 

Cultivo de células de peritoneo

Una vez obtenidas, las células se centrifugaron, se realizó recuento en cámara de Neubauer, se observó morfología por Giemsa y se determinó viabilidad con azul Trypan. Se trabajó con el mismo número de células adherentes o totales por cada animal, dependiendo del tipo de estudio.

 

Determinación del estallido respiratorio en células adherentes

Se realizó mediante la técnica de reducción del NBT, en células peritoneales de ambos grupos de ratones, previo y durante las primeras horas post infección. Las células (200.000) se incubaron durante 2 horas a 37ºC. Se descartaron las no adherentes (linfocitos) y se lavaron las adherentes (macrófagos-neutrófilos). Simultáneamente, en otros tubos se opsonizaron tripomastigotes de T. cruzi (antígeno específico) con suero de ratón normal o infectado crónico. Se incubó cada sistema con las células adherentes de infectados y controles (relación estímulo/célula 2:1) y se agregó NBT (Sigma). Luego de una hora de incubación a 37ºC se frenó la reacción con HCl. Se centrifugó, se descartó el sobrenadante, se agregó dioxano para extraer la fracción coloreada y se leyó la absorbancia a 540 nm en un espectrofotómetro (Metrolab 980)

 

Determinación de óxido nítrico por reacción de Griess

Se separaron las células no adherentes y se mantuvieron en baño de hielo. Las adherentes (200.000) se incubaron 2 horas con tripomastigotes de T. cruzi (relación 5:1 parásito/célula), se lavaron con RPMI - suero fetal 10% y se agregaron las no adherentes, se cultivaron a 37ºC y 5% CO2. Al cabo de 72 horas se tomaron 100 μL de sobrenadante al que se le agregaron 100 μl de reactivo de Griess; la absorbancia se leyó a 540 nm en un espectrofotómetro (Metrolab 980) y se determinó la concentración de NO utilizando un estándar de nitritos según la técnica de Muller et al.17 Los resultados se expresaron como niveles de nitrito (µM).

 

Determinación de la activación de arginasa

La actividad arginasa (medida por los niveles de urea) se evaluó en lisados de células adherentes peritoneales según la técnica descripta por Stempin et al.18 A 100.000 células lavadas previamente con medio RPMI se les agregó 50 μl de tritón 0,1% con inhibidores de proteasas, se dejó 30 minutos a temperatura ambiente y se agregaron 50 μl de MnCl2 10 mM y Tris HCl 50 mM para activar la enzima durante 10 minutos a 55ºC. Se agregó 25 μl de L-arginina y luego de una hora a 37ºC se frenó la reacción con solución ácida de H3PO4-H2SO4. Se agregó el reactivo 25 μl de ISPF. Se leyó la absorbancia a 540 nm en un espectrofotómetro (Metrolab 980). Se determinó la concentración de urea utilizando diluciones seriadas de un estándar de urea (0,6 g%). Los resultados se expresaron como µg urea/ml/100.000 células.

 

Determinación de IL-6 en líquido peritoneal

Se realizó por ELISA con equipo comercial (eBioscence). Brevemente, las muestras y las diluciones del estándar se incubaron en las placas sensibilizadas con anticuerpo monoclonal anti IL-6. Luego del lavado se agregó anti IL-6 conjugado con peroxidasa. Se reveló con estreptavidina y tetrametilbencidina, la reacción se frenó con H2SO4 y se midió la absorbancia a 450 nm en el mismo espectrofotómetro. Las concentraciones se calcularon en base a la curva realizada con las diluciones del estándar. La sensibilidad de la técnica fue de 4 pg/ml.

 

Determinación de anticuerpos específicos por enzimoinmunoensayo (ELISA)

Se sensibilizaron placas de poliestireno con 30 μg/ml de antígenos de T. cruzi durante toda la noche. Se bloqueó con PBS–albúmina durante 2 horas y luego se incubaron las muestras de líquido peritoneal durante 2 horas. Se lavó con PBS-Tween 0,05% y se agregó anti IgM o anti IgG conjugadas a peroxidasa. Se reveló con estreptavidina y tetrametilbencidina. Se midió la densidad óptica (D.O) a 450 nm.

 

Criterios éticos para el uso de animales de experimentación

Los animales de experimentación utilizados en el presente trabajo fueron tratados según estándares éticos de acuerdo con la Guide for the Care and Use of Laboratory Animals, Institute of Laboratory Animal Resources, National Research Council, National Academy Press, 1996.

Análisis estadístico

Las variables estudiadas en animales controles e infectados se analizaron mediante el test t, considerando que diferencia entre los distintos grupos era significativa cuando p<0,05.

 

Resultados

 

1. Curva de parasitemia.

En el Gráfico 1 se pueden observar los niveles de tripomastigotes circulantes, los cuales aumentan con la evolución de la infección. Los recuentos se realizaron hasta los 20 días posinfección, debido a que después de este período la mortalidad fue del 95%.

 

2. El estallido respiratorio aumenta en los animales infectados.

En el Gráfico 2 están representados los incrementos de la reducción del NBT en los animales infectados respecto de los controles. La diferencia fue estadísticamente significativa a las 12 horas posinfección (C vs. I; p<0,05), independientemente de que el estímulo específico fuera previamente opsonizado con suero de animales infectados crónicos o de ratones normales.

 

3. Los niveles de NO en sobrenadante de cultivo de células peritoneales están relacionados con el aumento de parásitos circulantes.

Es de destacar que in vivo no se pudo detectar NO directamente en LP incluso con previa reducción de nitratos en nitritos. Esto probablemente se deba a la elevada dilución que debe realizarse con el medio de cultivo RPMI (2,5 ml/ratón) para la obtención del LP. Para poder determinar estos niveles de NO se realizaron cultivos con células peritoneales obtenidas a diferentes tiempos posinfección, como los detallados en Materiales y métodos

En el Gráfico 3 se puede observar que la concentración de NO medida en sobrenadante de cultivo de células peritoneales reestimuladas in vitro aumenta en relación directa con el número de parásitos circulantes y con la evolución de la infección. Respecto de los niveles basales de NO, el incremento fue estadísticamente significativo recién a los 20 días posinfección (C vs. I; p=0,037). Estos resultados sugieren que las células que se encuentran en el sitio de infección inducen un aumento de la producción in vitro de este mediador.

 

4. La activación de arginasa está controlada durante la infección con T. cruzi.

Los niveles de urea, marcadores de la vía metabólica de la arginasa, se mantuvieron por debajo de valores basales con una ligera tendencia a disminuir con la evolución de la infección. Como se observa en el Gráfico 4, presenta un patrón inverso a la producción de NO, lo que sugiere una polarización del metabolismo de L-arginina hacia la activación de NOSi. En efecto, la concentracion de urea a las 3 y 12 horas y a los 15 días posinfección fue relativamente similar a los controles. En cambio, sí se observó una disminución significativa a los 20 días posinfección (C vs. I; p=0,012).

 

5. IL-6 aumenta significativamente a nivel local desde las primeras horas de la infección.

En la Tabla 1 se muestran los niveles de IL-6 determinados directamente en LP desde las primeras horas de infección. Como se puede observar en los diferentes tiempos estudiados, hubo aumento significativo en los animales infectados desde las primeras horas posinfección hasta los 15 días posinfección (p<0,05), momento a partir del cual comenzaron a disminuir.

 

6. La infección induce al final de la etapa aguda, respuesta adaptativa a nivel local

En el Gráfico 5 se observa un incremento significativo de anticuerpos específicos en LP con la evolución de la infección, presentando mayores niveles de IgM, como era de esperar. Por otra parte, los niveles de IgG hallados revelaron incremento de esta inmunoglobulina, el cual fue significativo respecto a los valores basales recién a los 20 días posinfección (C vs. I; p<0,05).

Paralelamente se determinaron anticuerpos específicos por hemaglutinación e inmunofluorescencia indirecta y se observó, tal como se esperaba, un importante aumento de los niveles de anticuerpos a nivel local al final del período agudo en respuesta a la infección corroborando los hallazgos previos (datos no mostrados).

 

Discusión

 

El T. cruzi, al igual que otros protozoos, infecta y se replica en células nucleadas; sin embargo, es destruido por el macrófago mediante la activación de diferentes mecanismos microbicidas, entre ellos la producción de radicales libres de oxígeno y la síntesis de NO. Se ha postulado que la evolución de la infección a nivel experimental depende en gran medida de la carga parasitaria, relacionada con la eficacia de los mecanismos de respuesta innata en las primeras horas de interacción hospedador-parásito, la cual si es baja, minimizaría los daños en el período crónico de la enfermedad. En este modelo se observa un incremento significativo de la reducción del NBT al inicio de la infección (12 horas pos desafío), lo cual estaría asociado a una adecuada respuesta de los animales, si bien no es el único factor involucrado en la eliminación del parásito. En efecto, el proceso de fagocitosis gatilla el estallido respiratorio en el macrófago cuando el complejo antígeno-opsoninas se une a sus receptores; posteriormente, el aumento de calcio intracelular induce la activación de la NADPH oxidasa. Como consecuencia de ello, se liberan radicales del oxígeno y superóxidos que se combinan con NO y forman peroxinitritos con potentes efectos microbicidas.13 Por su parte, la importancia del NO en la infección con T. cruzi fue demostrada en modelos experimentales. En este sentido, Vespa et al.,19 utilizando distintas cepas de ratones, encontraron altos niveles de NO en sobrenadante de cultivo de esplenocitos durante la fase aguda, los cuales se correlacionaron con la resistencia a la infección. Sin embargo, en trabajos previos desarrollados en nuestro laboratorio se demostraron, en animales que cursaban el final del período agudo de la infección, altas concentraciones de NO a nivel sistémico, asociadas con parasitemias elevadas y alrededor del 95% de mortalidad, lo cual, junto con la síntesis de citocinas inflamatorias como IL-12 y TNF-α estaría relacionado a la morbimortalidad de la infección.20 Estos resultados coinciden con lo comunicado por otros autores, los que hallaron una mayor inducción de la NOSi por TNF-α, INF-γ y quimiocinas producidas en la etapa aguda de la infección, que junto al NO no sólo intervienen en la eliminación del parásito sino también, en elevadas concentraciones, en el daño tisular provocado por el estrés oxidativo generado a nivel local.21,22 En el presente trabajo, los niveles elevados de NO en LP desde las primeras horas posinfección y la escasa producción de urea, observados en el estudio del metabolismo de arginina, sugieren una mayor inducción de NOSi, mientras la activación de arginasa estaría regulada. Esto indicaría que existe una regulación recíproca entre las dos vías de activación del macrófago donde el consumo de arginina, sustrato de NOSi y arginasa, se produce mediante un mecanismo estrictamente regulado.18,22 De esta forma, la producción de NO es gatillada rápidamente en las células de la respuesta innata luego de la fagocitosis del parásito, ejerciendo actividad microbicida directa sobre él, y modulando la actividad biológica de las células en el sitio de infección.

Por otra parte, es importante destacar que la activación de células efectoras luego de la fagocitosis del parásito no sólo contribuye a la eliminación sino también a la iniciación de la respuesta inflamatoria.23 Es conocido que citocinas y receptores solubles están involucrados en procesos inflamatorios y en la patogenia de enfermedades parasitarias y bacterianas. Chandrasekar et al.24 detectaron citocinas proinflamatorias (IL-6, TNF-α, IL-1β) en miocardio de ratones infectados por T. cruzi, lo cual sugiere el probable rol en la injuria de la función cardíaca. En el presente trabajo se observó que los niveles de IL-6 a nivel local (LP) aumentaron desde las primeras horas de infección. Estos resultados coinciden con lo observado en trabajos previos en nuestro laboratorio, en suero de animales infectados, en los cuales los niveles de IL-6 se correlacionaron con altas parasitemias y mortalidad, si bien fueron elevados recién a partir de los 10 días posinfección.16,20 Este aumento de IL-6 estaría contribuyendo en la inducción del proceso inflamatorio precoz, como también en la diferenciación de células efectoras productoras de anticuerpos.

Por su parte, los niveles de IgM hallados fueron más precoces que los de IgG, resultados esperables en el curso de la infección del período agudo, ya que ambas aumentan con la evolución de la infección y podrían estar involucradas en la eliminación del parásito por diferentes mecanismos, como opsonización, lisis, fijación de complemento, etc.

Por otra parte, las investigaciones realizadas en humanos con enfermedad de Chagas revelan hallazgos similares. En efecto, en estudios realizados en nuestro laboratorio,25 en niños de área endémica que cursaban el período agudo de la enfermedad, se detectó a nivel sistémico aumento significativo de receptor soluble de IL-2 y de sCD8. En algunos pacientes también se observó aumento de TNF-α, IL-6 y sCD4, con respecto a niños sanos. Es de destacar que estos niveles se normalizaron luego de la terapia antiparasitaria. Asimismo, en los estudios realizados en pacientes adultos con enfermedad de Chagas crónica sobre necropsias de tejido cardíaco, se observaron altas concentraciones de NOSi,26 confirmando que estos mediadores solubles podrían desencadenar alteraciones patológicas a nivel de células blanco. Con respecto a mecanismos mediados por anticuerpos, Gea et al.27 encontraron altos niveles de inmunoglobulinas específicas contra galectina 1, biomolécula con propiedades inmunomodulatorias, en suero de pacientes tanto en la fase aguda como crónica de la infección, los cuales estaban correlacionados con la severidad del daño cardíaco.

Debe destacarse que es la primera vez que se comunica el estudio de la respuesta inmune generada en el peritoneo, lugar de la infección por T. cruzi, desde el inicio de la misma. En efecto, los resultados observados a nivel experimental en el presente trabajo demostraron la compartamentalización de la respuesta inmune, la producción temprana de mediadores inflamatorios como radicales libres, NO, y el aumento precoz de una citocina proinflamatoria como IL-6. Estos mediadores, si bien tienen efectos microbicidas, también poseen efectos deletéreos para el hospedador, lo cual apoya la teoría de la acción del parásito.8,28 Sumado a ello, la presencia de anticuerpos específicos podría generar a largo plazo una respuesta inmune contra las células del hospedador si se considera la teoría de la autoinmunidad.

En conclusión, los hallazgos referidos, tomados en conjunto, explicarían algunos de los múltiples mecanismos involucrados no sólo en la eliminación del T. cruzi, sino también, directamente, en la evolución y la patogenia de la infección. Estos resultados alientan la prosecución de estudios tendientes a mejorar el conocimiento de los eventos inmunológicos tempranos en la infección por T. cruzi, para identificar células y moléculas target cruciales con el objetivo de avanzar en la profilaxis o inmunointervención en la enfermedad de Chagas.

 

Financiamiento

Este trabajo fue realizado con fondos de SECyT-UNC y de Coordinación Nacional de Control de Vectores.

 

Agradecimientos

Los autores agradecen al Dr. Edgardo Moretti por la lectura del manuscrito y sus sugerencias.

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Prevalencia de asma y su impacto en la calidad de vida de los adolescentes escolarizados de la ciudad

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